Genetik mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamarını Gen Teknolojileri, DNA Parmak İzi, Polimeraz Zincir Reaksiyonu, Jel Elektroforez Tekniği, Kök Hücre ve Gen Klonlama başlıkları altında inceleyelim.
a) Gen Teknolojileri
Biyolojideki hızlı gelişim, gen teknolojisi ve genetik mühendisliğindeki biyoteknolojik çalışmaları hızlandırmıştır. Canlılar üzerinde uygulanan gen teknolojileri, hayatın birçok alanında yeni ufuklar açmıştır. Genetik çalışmalar yapılırken bilgisayar teknolojisinin de kullanılması, gelişimdeki hızı bir kat daha artırmıştır.
Önemli genetik mühendisliği çalışmalarından biri, genom projeleridir. Bu projelerde biyolojik araştırmalarda önemi olan maya, meyve sineği, fare vb. diğer canlı türlerinin genom haritalarının çıkarılması amaçlanmıştır. 1990 yılında ise insan genomunun haritalanması amacıyla “İnsan Genom Projesi” başlatılmıştır. 13 yıl süren proje sonucunda insan genomunu oluşturan baz çiftlerinin DNA dizilimi çıkarılmıştır.
İnsan Genom Projesi ve karşılaştırmalı genomik çalışmalar, diğer organizmalarla çok sayıda ortak genimiz olduğunu göstermiştir. Örneğin insan genlerinin yaklaşık %50’si Drosophila melanogaster [Drosofila melanogaster (sirke sineği)] ile %90’ı ise farelerle ortaktır. İnsanlar üzerinde deney yapmak mümkün olmadığından bilim insanları, deneylerinde model organizmaları kullanmaktadır. İnsanlarda görülen bazı hastalıklar aynı zamanda model organizmalarda da görülür. Bu sebeple ilaçların etkinlik ve güvenilirliğini saptamak, hastalık genlerini tanımlamak gibi çalışmalarda model organizmalar kullanılmaktadır.
Model organizmalar, bilim insanlarının üzerinde çalışılması zor olan diğer türler hakkında bilgi edinmek için kullandıkları canlılardır. Genetik çalışmalarda kullanılacak iyi bir model organizma; kolay büyüyebilmeli, kısa sürede nesil verebilmeli, birçok yavru üretebilmeli, kolayca mutasyona uğratılabilmeli ve çaprazlanabilmelidir. Model organizmaları, laboratuvar ortamında üretmek ve bunların üretimlerini devam ettirmek düşük maliyetli ve kolaydır.
Yıllar boyunca model organizmalar hakkında çok fazla bilgi edinilmiş olması, bu organizmaların bilimsel çalışmalarda kullanılmasını cazip hâle getirmiştir. Bir model organizma örneği olan Drosophila melanogaster, insanda bulunan çeşitli hastalık genlerini taşır. Bundan dolayı Drosophila melanogasteri kullanarak insan genlerinin fonksiyonu hakkında bilgi edinilebilir. Bu bilgiler ışığında pankreas kanseri, prostat kanseri, lösemi ve diğer bazı hastalıklarla ilgili çalışmalar yapılabilir.
Başka bir model organizma örneği olan Saccharomyces cerevisiae [Sakhoromises serevise (maya mantarı)] ise insana ait hastalık genlerinin benzerlerini taşımasından dolayı yeni ilaçların denenmesinde kullanılır. Danio rerio [Danio reyro (zebra balığı)] model organizması da insana ait birçok hastalık ve gelişim genlerini taşır. Bundan dolayı Alzheimer, kanser ve kalp hastalıklarının tedavisi için geliştirilen yeni ilaçların denenmesinde kullanılır.
b) DNA Parmak İzi
Tek yumurta ikizleri dışında her organizmanın genomundaki baz dizilimi farklıdır. Bireylerin çeşitlilik gösteren tekrarlı DNA dizilerinin belirlenmesi, bireyin kendine özgü olan DNA parmak izinin çıkarılmasına olanak sağlar. Her bireyin DNA parmak izi farklıdır.
DNA parmak izi yöntemi, suçluların tespitinde kullanılan yaygın bir yöntemdir. Bu yöntemle olay yerinde bulunan kan, sindirim atığı, tükürük, kıl, tırnak ve doku kalıntıları kriminal çalışmalarla incelenerek suçlunun bulunması sağlanır.
DNA parmak izi yöntemi; safkan hayvan ırklarının belirlenmesi, babalık davaları, bitki ve hayvan türlerinin korunması çalışmaları dâhil çok geniş bir uygulama alanına sahiptir. DNA’nın şüpheliye ait olup olmadığını tespit etmek için çok çeşitli teknikler kullanılabilir. Son yıllarda bu tekniklerden en sık kullanılanı PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) tekniğidir. Hem hızlı çalışılması (sadece birkaç saat) hem de çok küçük miktarda DNA örneğinin (yaklaşık bir nanogram) yeterli olmasından dolayı tercih edilmektedir.
c) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
PCR, 1985 yılında Kary Mullis (Kari Mullis) tarafından bulunmuştur. Kary Mullis bu buluşu ile 1993 yılında kimya dalında Nobel Ödülü almıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction-PCR), herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’daki özgün bölgelerin çoğaltılmasını sağlayan basit ama çok başarılı bir DNA sentezi yöntemidir. PCR ile belirli DNA parçalarının büyük miktarlarda kopyası üretilebilmektedir.
Aynı DNA’nın çok miktarda kopyasının bulunması araştırmacıların genler üzerindeki çalışmalarını kolaylaştırmaktadır. Metot basitçe, nükleik asitlerin tüp içerisinde uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır. DNA’nın iki zincirini bir arada tutan hidrojen bağları, ortam sıcaklığında değişiklikler yapılarak kırılabilir ve tekrar birleştirilebilir. DNA’nın bu özelliği PCR’nin yapılmasına olanak sağlar. PCR, 3 aşamada gerçekleşir.
- DNA, nükleotit, DNA polimeraz ve DNA primer karışımı 95 oC’de ısıtılır. Çoğaltılmak istenen DNA’nın yüksek sıcaklıkta (çoğunlukla 95 °C) denatürasyonu sağlanır. DNA zincirlerini birbirine bağlayan hidrojen bağları zayıflatılarak iki zincirin birbirinden ayrılması sağlanır. Sonra genellikle 50-55 °C civarına soğutulur.
- Primerler, ayrılmış olan DNA parçalarına bağlanır.
- DNA polimeraz, DNA sentezine başlayarak zincirlerin geri kalan bölümlerinde tamamlayıcı olan yeni zincirleri oluşturur. Bu süreç çoğunlukla 72 oC’de yürütülür.
PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı Thermus aquaticus (Termus akuatikus) bakterisinden izole edilen Taq DNA polimeraz enziminin bulunması yapmıştır. Çünkü bu enzim, yüksek sıcaklıklara dayanabilen bir enzimdir. PCR yaygın olarak tıbbî ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, İnsan Genom Projesi ve diğer genom projelerinde, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.
ç) Jel Elektroforez Tekniği
Jel elektroforezi, saflaştırılmış nükleik asit ve proteinlerin molekül ağırlığı, miktarı ve alt tiplerinin saptanmasında yaygın olarak kullanılan moleküler bir inceleme yöntemidir. En çok kullanılan jel elektroforezi yöntemleri, agaroz jel elektroforezi ve poliakrilamid jel elektroforezidir. Nükleik asitler için genellikle agaroz jel, proteinler için ise poliakrilamid jel elektroforezi kullanılmaktadır. Poliakrilamid jel elektroforezi hemen hemen tüm protein tiplerinin analizinde uygulanabilmektedir.
Elektroforetik analiz, elektriksel bir alanda ve ortamda çözünmüş moleküllerin elektrik yüklerine göre göç etmeleri prensibine dayanır. Büyük moleküller jel üzerinde yürümekte zorluk çekerken küçük moleküller daha hızlı ve rahat hareket edebilir. Molekülün anoda (+ kutup) ya da katoda (- kutup) doğru hareket etmesi, molekül üzerindeki net yük ile belirlenir. DNA ve RNA molekülleri, serbest fosfat gruplarından dolayı eksi yüklü moleküllerdir. Bu nedenle jel üzerinde katottan anoda doğru hareketlenirler.
Protein molekülleri üzerlerinde hem artı hem de eksi yükler taşıdıkları için üzerlerindeki net yük miktarı ortamın pH’si değiştirilerek istenirse artı, istenirse eksi hâle getirilebilir. Mesela ortam pH’sinin 5’ten büyük olduğu durumlarda proteinler, eksi yüklenirler ve jel üzerinde anoda doğru hareketlenirler. Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, ortamın yoğunluğuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir. Kullanılan molekülün jel üzerindeki yerini belirlemek için ortamda UV ışığı altında floresan etki gösteren etidyum bromürün (EB) veya benzeri bir ışıyıcı maddenin bulunması gerekmektedir.
Elektroforez deneyleri tampon çözeltileri içinde yapılır. Bunun iki temel nedeni vardır. Birinci neden akımın geçişini sağlamak için ortamın elektrolit miktarını artırmaktır. İkinci nedense ortamın pH’sinde meydana gelebilecek radikal değişimlere izin vermemektir.
Agaroz jel hazırlama aşamaları
- Agaroz jel tankının hazırlanması (A),
- Agaroz jelin jel tankına dökülmesi (B),
- Tarağın jel tankına dökülen agaroz jelin başlangıç noktasına yerleştirilmesi (C),
- DNA örneklerinin agoroz jel içerisindeki tarakla açılan bölümlere otomatik pipet yardımıyla yerleştirilmesi (Ç),
- Jel tankının yürütme kabına yerleştirilmesi, voltajın ayarlanması ve elektroforeze başlanması (D-E), Jel tankı yürütme işleminden sonra görüntüleme cihazına konularak görüntünün elde edilmesi sağlanır.
Farklı DNA örneklerinin agoroz jel elektroforez yöntemiyle elde edilmiş görüntüleri aşağıdaki DNA parmak izi görselinde verilmiştir. Bu görüntülerden hareketle DNA parçaları üzerinde bulunan bazların yeri, miktarı ve hatta DNA’nın ağırlığıyla ilgili çalışmalar yapılabilir.
Agaroz jel elektroforez tekniği; çeşitli amaçlar için izole edilen DNA ve RNA’ların tanımlanabilmesi, temizliğinin kontrolü, hangi formda olduğunun belirlenebilmesi, büyüklüğünün saptanabilmesi ve özellikle genetik mühendisliği teknikleri ile DNA yapısında oluşturulan değişikliklerden sonra elde edilen yeni formların incelenmesi yönünden genetik alanında önemli bir deneysel sistem oluşturmaktadır. Özellikle tıpta ve biyokimyada kandaki çeşitli protein ve lipitlerin ayrılması, tanınması ve miktarlarının ölçülmesinde bu teknikten yararlanılabilir.
d) Kök Hücre
Kök hücreler; kendini yenileme özelliğine sahip olan, vücut içinde veya uygun şartlar sağlandığında laboratuvar ortamında birçok hücre tipine dönüşebilen, farklılaşmamış hücrelerdir. Kök hücrelerin sınırsız bölünebilme, kendini yenileyebilme, çeşitli organ ve dokulara dönüşebilme yetenekleri vardır. Bu hücreler kan, kordon kanı, kemik iliği, embriyo vb. yapılardan elde edilir. Genel olarak 3 tip kök hücre bulunur.
Yetişkin Kök Hücreler
Yetişkin kök hücreleri vücutta doku ve organlarda bulunan farklılaşmamış hücrelerdir. Her yaştaki insanda bulunan bu hücreler, işlevselliği bozulan veya ölen hücrelerin yerini alabilir. Kök hücreler; deri, kemik iliği ve yağ dokuda bol miktarda bulunur.
Kordon Kanından Elde Edilen Kök Hücreler
Doğum sırasında göbek kordonundan elde edilen kök hücreler, kordon kan bankalarında saklanır. Özellikle akraba ve gen benzerliği olan hastalarda kök hücre tedavisinde kullanılır.
Embriyonik Kök Hücreler
Embriyonik kök hücreler, embriyonun erken evrelerinde elde edilir. Bu kök hücreleri kültür ortamında yetiştirmek daha kolaydır. Daha hızlı çoğalma ve daha fazla hücre tipine dönüşebilme yetenekleri vardır.
Kök hücre teknolojisi sayesinde omurilik yaralanmaları, kanser, sinir sistemi hastalıkları (Parkinson, Alzheimer) ve hasarları, diyabet, kalp hastalıkları, organ yetmezlikleri, kemik hastalıkları gibi günümüzde tedavisi olmayan veya sınırlı olan hastalıklarda kök hücrelerinin klinik uygulamalarıyla ilgili araştırmalar yapılmaktadır.
e) Gen Klonlama
20. yüzyılın ikinci yarısında gelişmeye başlayan gen teknolojileri; gıda, tarım ve hayvancılık, madencilik, tıp, sağlık ve endüstri gibi alanlarda kullanılmaktadır. İstenilen gen plazmit veya virüs gibi bir vektör ile bakteri hücresi gibi alıcı bir hücreye aktarılır. Sonra da bu bakteri aracılığı ile pek çok kopyasının üretilmesine gen klonlama denir.
Genlerin klonlanmasında çoğunlukla bakterilerden yararlanılır. Çünkü bakteriler, hızlı çoğalır ve kolaylıkla izole edilebilir. Klonlamada bakteri sitoplazmasında bulunan ve hücre DNA’sından bağımsız olarak çoğalan, plazmit adı verilen halka şeklindeki küçük DNA parçaları kullanılır. Genetik mühendisliği çalışmalarında rekombinant DNA teknolojisi kullanılır. Bu teknolojide istenilen özelliği taşıyan gen, kesilerek farklı bir DNA molekülü ile birleştirilir. Oluşan yeni DNA’ya rekombinant DNA adı verilir.
Rekombinant DNA’nın aktarıldığı canlılar, yeni genetik özellikler kazanır. Bu tür canlılara transgenik canlı ya da genetiği değiştirilmiş organizma (GDO) denir. Bakterilerin kullanıldığı gen klonlama işleminin basamakları şöyle sıralanabilir:
- İstenilen geni taşıyan DNA molekülü ile vektör olarak kullanılacak bakteri plazmiti saf olarak elde edilir.
- Vektör olarak kullanılacak plazmit ve klonlanacak gen restriksiyon enzimleri ile kesilir.
- Klonlanacak gende ve kesilen plazmitte oluşan yapışkan uçlar, DNA ligaz enzimi yardımı ile birleştirilerek rekombinant DNA molekülü elde edilir. Böylece klonlanacak gen, vektör olarak kullanılan plazmidin içine yerleşmiş olur.
- Rekombinant DNA, bir bakteri hücresine aktarılır ve rekombinant bakteri hücresi oluşturulur.
- Bakterilerin rekombinant DNA’larının çok sayıda kopyası oluşur.
